DYNAMIC研究关于循环肿瘤DNA（ctDNA）指导的辅助化疗（ACT）与标准治疗方案对比的早期数据达到了主要研究终点，证实该方案在不降低Ⅱ期结肠癌患者2年无复发生存率（RFS）的前提下，减少了辅助化疗的使用。本文报告了该研究关于总生存期、ctDNA清除情况及ctDNA水平的其他预设分析结果。
在中位随访59.7个月时，ctDNA指导组和标准治疗组的5年RFS分别为88%和87%（差值1.1%，95%置信区间为-5.8%至8.0%），5年总生存期也相近（93.8% vs 93.3%，风险比（HR）=1.05，P=0.887）。在接受治疗的ctDNA阳性患者中，35/40例患者（87.5%）在辅助化疗结束时（EOT）实现了ctDNA清除。术后血浆中每毫升肿瘤源性突变分子数高于中位数的患者，其5年RFS更差（HR=10.62，P=0.005）。一项事后分析显示，采用新型检测方法对接受治疗的ctDNA阳性患者化疗结束时的ctDNA清除情况进行评估（该方法为每位患者平均检测29个肿瘤源性突变），结果发现实现ctDNA清除的患者5年无复发概率达97%，而ctDNA持续阳性的患者该概率为0%（P<0.001）。
DYNAMIC研究的成熟结局数据证实，ctDNA指导的辅助化疗方案适用于Ⅱ期结肠癌患者，且可依据ctDNA负荷和化疗结束时的检测结果，对ctDNA阳性患者进行进一步的风险分层。
展开剩余95%研究背景
循环肿瘤DNA（ctDNA）是多种实体瘤分子残留病灶的潜在标志物，其中也包括接受根治性切除的结直肠癌。早期观察性研究表明，在未接受治疗的结直肠癌患者中，检测到ctDNA意味着复发风险接近100%。DYNAMIC研究将455例Ⅱ期结肠癌患者随机分为两组，一组采用ctDNA指导的辅助化疗方案（ctDNA阳性患者接受辅助化疗，ctDNA阴性患者仅接受观察），另一组依据传统临床病理标准接受标准治疗。该研究的初步分析显示，与标准治疗组（28%）相比，依据术后ctDNA结果指导治疗的患者接受化疗的比例显著降低（15%），且两组的2年RFS无显著差异。
传统上，Ⅱ期结肠癌患者是否接受辅助化疗，主要根据患者是否存在高危临床病理特征来判断。这一方案存在局限性，以T4分期这一高危特征为例，其虽与复发风险升高相关，但与辅助化疗的获益之间并无明确关联。在约20%存在错配修复缺陷（dMMR）的Ⅱ期结肠癌患者中，预后通常较好，目前的诊疗指南不建议此类患者接受辅助治疗。尽管肿瘤中的单个基因突变目前尚未纳入常规临床诊疗的参考依据，但在早期肿瘤中具有潜在研究价值，例如已有研究表明，KRAS和BRAF突变对患者预后存在不良影响。而在早期结肠癌队列中，上述基因突变与术后ctDNA状态之间的关联尚未得到研究。
除了通过定性检测判断肿瘤源性DNA的存在与否，ctDNA的定量检测也可作为评估微小残留病负荷的潜在指标。对ctDNA分子负荷的分析，能够对术后ctDNA阳性患者的复发风险进行进一步分层。辅助治疗后多次检测ctDNA，也可作为实时评估辅助治疗疗效或耐药性的有效标志物。多项观察性研究数据表明，ctDNA持续可检测到是患者预后不良的指标。例如在GALAXY研究中，术后ctDNA阳性且在辅助化疗后实现ctDNA清除的患者，其12个月RFS显著高于ctDNA持续阳性的患者（85.7% vs 20.7%，P<0.0001）。
本文报告DYNAMIC试验的更新数据，包括成熟的RFS和总生存期数据、化疗结束时ctDNA状态与患者结局的关联、重点亚组的临床结局、术后ctDNA分子负荷，以及一种新型检测方法的相关研究结果。
研究方法
DYNAMIC研究纳入标准：经组织学证实为Ⅱ期（T3-4、N0、M0）结肠或直肠腺癌，接受根治性切除且切缘阴性；直肠癌患者若未接受新辅助放化疗或不计划接受术后放化疗，可纳入研究；术后28天内可提供代表性的石蜡包埋肿瘤样本用于分子检测；东部肿瘤协作组（ECOG）体力状况评分为0~2分，医学上适合接受奥沙利铂或氟尿嘧啶为基础的辅助化疗；随访可及；入组前8周内完成的胸部、腹部和盆腔计算机断层扫描（CT）检查无肉眼可见的转移性疾病证据。研究排除标准：合并同时性原发结直肠癌；近3年内有其他原发恶性肿瘤病史（非黑色素瘤皮肤癌和宫颈原位癌除外）；接受过新辅助放化疗；存在可能影响研究方案依从性的内科、精神疾病或职业因素。
患者在术后3周内入组，术后4周内需提供切除标本的足量肿瘤样本用于突变分析。入组后，患者按2:1的比例随机分为两组，一组依据ctDNA检测结果接受治疗（ctDNA指导组），另一组由主治医生依据传统临床病理标准制定治疗方案（标准治疗组）。采用区组随机化方法对患者进行分组，分层因素为研究中心所在地（区域或城市）和T分期（T3或T4），区组大小为3，随机化表由R软件生成，通过REDCap系统为每位受试者分配分组。ctDNA指导组患者在术后第4周和第7周采集血液样本，同步进行ctDNA检测，检测结果在术后8~10周反馈给主治医生；术后第4周或第7周任意一次ctDNA检测阳性的患者，接受氟尿嘧啶单药或奥沙利铂为基础的辅助化疗，化疗方案由临床医生决定；两次ctDNA检测均为阴性的患者，不接受辅助化疗。标准治疗组患者的所有治疗决策均依据传统临床病理标准。两组患者可接受的化疗方案包括：氟尿嘧啶单药（改良De Gramont方案、QUASAR方案、罗斯韦尔公园方案或卡培他滨），或奥沙利铂为基础的双药化疗（改良FOLFOX6方案或CAPOX/XELOX方案）。2018年2月，研究方案进行修订，鉴于IDEA荟萃分析的新数据显示3个月辅助化疗或非劣效于6个月，允许临床医生灵活选择3个月的化疗时长。化疗剂量调整遵循当地标准临床实践。
两组患者均在入组后前2年每3个月检测一次血清癌胚抗原（CEA），随后3年每6个月检测一次；前2年每6个月完成一次胸部、腹部和盆腔增强CT检查，第3年完成一次。所有患者的随访时长均为随机分组后5年，随访内容包括疾病复发、第二原发肿瘤和死亡情况。由于本研究中使用的均为标准治疗方案，未对不良事件进行评估。
本研究采用基于tumor-informed的个性化ctDNA检测方法：首先对每位患者的肿瘤组织进行测序，鉴定出体细胞突变，再在血浆样本中检测相同突变的存在情况。为实现DYNAMIC研究的主要研究终点（选择适合接受辅助化疗的患者），本研究对结直肠癌常见突变基因进行靶向测序，鉴定出体细胞变异并用于血浆检测；为实现探索性研究终点（评估辅助治疗后的微小残留病），本研究检测了更多的变异位点，具体而言，对38例有化疗结束时剩余血浆样本的患者，其肿瘤组织均进行了全外显子测序（n=35）或全外显子联合全基因组测序（n=3）。所有肿瘤组织突变检测和ctDNA分析均由本研究的科研人员完成。
肿瘤组织靶向测序：对原发灶的石蜡包埋肿瘤组织进行测序，检测15个结直肠癌常见突变基因的体细胞突变，包括SMAD4、TP53、AKT1、APC、BRAF、CTNNB1、ERBB3、FBXW7、HRAS、KRAS、NRAS、PIK3CA、PPP2R1A、RNF43和POLE。在解剖显微镜下对肿瘤组织切片进行显微切割，以富集肿瘤细胞；采用Qiagen FFPE试剂盒提取DNA。引物设计和测序结果分析方法如既往研究所述。
肿瘤组织全外显子/全基因组测序：对肿瘤组织和配对的白细胞样本进行全外显子测序，平均测序深度为200×；对3例患者额外进行全基因组测序，在Illumina NovaSeq平台完成，平均测序深度>20×。排除配对白细胞样本中存在的突变，以及重复区域、比对/扩增困难区域的突变和常见多态性，筛选出肿瘤特异性体细胞突变。
血浆样本采集：使用K2-EDTA采血管采集30~60ml外周血，3小时内进行两次离心处理，第一次离心后收集白膜层；所有样本均于-80℃保存，待提取和分析。采用Qiagen循环核酸提取试剂盒，从每位患者的血液样本中纯化出至少10ml血浆。
基于肿瘤靶向测序的ctDNA检测：对每位患者，至少检测1个肿瘤组织靶向测序鉴定出的突变，并在血浆游离DNA中进行验证。采用Safe-Sequencing System的误差降低技术检测低频突变，将血浆DNA分为12、24或95个反应孔进行检测；以白细胞DNA作为对照，排除胚系多态性。若血浆DNA分为12或24个反应孔，根据精确置换检验判断ctDNA是否可检测到（阳性/阴性）：对比研究样本和对照样本各反应孔的平均突变等位基因频率，采用R软件perm包的permTS函数计算单侧P值，P<0.1时判定为ctDNA阳性。若血浆DNA分为95个反应孔，利用所有检测到的突变的等位基因频率，建立扩增子特异性的检测噪声分布；采用Fisher法合并肿瘤组织中鉴定出的突变对应的P值，得到患者的最终P值，同样以P<0.1为ctDNA阳性判定标准。根据血浆样本中每个DNA片段的独特分子条形码/识别码数量，结合实验特异性的、已知单倍体基因组当量的正常血浆对照，估算血浆中的肿瘤分子数。
基于肿瘤全外显子/全基因组测序的ctDNA检测：针对全外显子或全基因组测序鉴定出的每个突变，设计SaferSeqS检测方法（一种低丰度突变检测方法技术，用UMI标记血液中每个ctDNA的双链，通过双链测序将错误率降至原有的1%以下）；采用罗氏KAPA HiFi HotStart ReadyMix试剂盒，对每位患者的所有突变进行多重PCR扩增，突变分析方法如既往研究所述。仅评估能唯一比对到参考基因组的突变位点（除突变位点外，其他位点均与参考基因组一致）。血浆检测时，需先通过上述多重PCR验证肿瘤全外显子/全基因组测序鉴定出的突变确实存在于肿瘤组织中，且该突变在患者配对的正常白细胞DNA和健康对照的未配对血浆样本中均不存在；此外，若某一突变在血浆中检测到的突变分子数与同一样本中的其他突变存在高度不一致（Z值>5），则剔除该突变。
研究结果
研究对象与治疗方案：
2015年8月10日至2019年8月2日期间，共455例患者被纳入随机分组，其中441例患者纳入意向治疗人群，包括294例ctDNA指导组患者和147例标准治疗组患者（图1）。两组患者的基线特征基本匹配（表1），ctDNA指导组和标准治疗组中T4期患者占比分别为15%和14%，dMMR肿瘤患者占比分别为20%和18%。ctDNA指导组有45例患者（15%）接受了至少1个周期的辅助化疗，标准治疗组有41例患者（28%）接受了至少1个周期的辅助化疗。从化疗方案来看，ctDNA指导组中6%的患者接受氟尿嘧啶单药化疗，9%的患者接受奥沙利铂为基础的双药化疗；标准治疗组中25%的患者接受氟尿嘧啶单药化疗，3%的患者接受奥沙利铂为基础的双药化疗（表1）。疾病复发后，ctDNA指导组54%的患者（13/24）和标准治疗组71%的患者（10/14）接受了根治性手术，切除寡转移灶（n=17）或局部复发病灶（n=6）。
图1
表1
所有患者的OS、DDS和RFS：
中位随访59.7个月（四分位距55.0~61.5个月）后，ctDNA指导组和标准治疗组的预设5年OS分别为93.8%和93.3%（风险比=1.05，95%置信区间0.47~2.37，P=0.887，图2a）。本研究中未发生与治疗相关的死亡事件。总体而言，ctDNA指导组有17例患者死亡（5.8%），标准治疗组有9例患者死亡（6.1%）。其中仅有11例死亡（42%）归因于结直肠癌复发，6例死亡（23%）因随访期间确诊其他恶性肿瘤，9例死亡与肿瘤无关。事后的疾病特异性生存期（DSS）分析显示，ctDNA指导组和标准治疗组的5年DSS估计值分别为97.9%和97.2%（风险比=1.19，95%置信区间0.35~4.09，P=0.792，图2b）。ctDNA指导组患者从疾病复发到死亡的中位时间为21个月，标准治疗组为26个月。
图2
ctDNA指导组中有24例患者（8.2%）出现疾病复发，9例患者（3%）无复发证据但死亡；标准治疗组中有14例患者（9.5%）出现疾病复发，3例患者（2%）无复发证据但死亡。ctDNA指导组和标准治疗组的5年RFS分别为88.3%和87.2%（绝对差值1.1%，95%置信区间-5.8%至8.0%，图2c）。73.7%的复发（38例中的28例）发生在随机分组后2年内，89.5%的复发（38例中的34例）发生在随机分组后3年内。ctDNA指导组患者从随机分组到疾病复发的中位时间为13个月，标准治疗组为18个月。
T4期和dMMR肿瘤患者的OS、DDS和RFS：
T4期是Ⅱ期结肠癌最强的不良预后危险因素，也是临床中制定辅助治疗方案的重要参考依据，因此本研究对T4期患者进行了预设的探索性亚组分析。在T4期患者中（ctDNA指导组n=44，标准治疗组n=20），ctDNA指导组和标准治疗组的5年OS估计值分别为90.5%和80.0%（风险比=2.16，95%置信区间0.53~8.79，P=0.27）；5年RFS分别为81.2%和70.0%（风险比=1.79，95%置信区间0.62~5.15，P=0.28）。仅对错配修复功能正常的T4期患者进行分析时，观察到了相似的趋势：ctDNA指导组的OS和RFS均优于标准治疗组（5年OS：87.1% vs 77.8%，P=0.363；5年RFS：74.6% vs 66.7%，P=0.495）。ctDNA指导组的T4期患者接受辅助化疗的比例显著低于标准治疗组（44例中的12例，27.3% vs 20例中的14例，70.0%，P=0.002）。在接受化疗的患者中，ctDNA指导组有7例（58.3%）采用奥沙利铂为基础的化疗方案，标准治疗组有2例（14.3%）采用该方案。
目前的诊疗指南不建议dMMR Ⅱ期结肠癌患者接受辅助治疗，但部分此类患者仍会出现疾病复发，因此本研究也对dMMR患者进行了预设的探索性亚组分析。ctDNA指导组和标准治疗组的5年DSS估计值分别为98.3%和100%（因其中一组无事件发生，风险比无法评估）。59例dMMR肿瘤患者中，5例（8.5%）术后检测到ctDNA。根据研究方案预设，上述5例患者均接受了辅助化疗，且在末次随访时均未出现疾病复发或死亡。标准治疗组的27例dMMR型患者中，3例（11.1%）接受了辅助化疗，1例患者出现疾病复发并死亡。
ctDNA指导组患者的OS、DDS和RFS：
本研究对ctDNA指导组进行了预设的RFS分析，以及事后的OS和DDS分析。舍恩菲尔德残差检验结果显示，所有结局指标均满足比例风险假设。ctDNA指导组的294例患者中，291例患者的术后ctDNA分析顺利完成。所有患者均在术后第4周和第7周采集血浆样本用于ctDNA检测，术后第7周的二次检测旨在通过增加术后检测时间和血浆样本量，提高检测的灵敏度。两个时间点的ctDNA检测结果如下：31例患者术后第4周和第7周ctDNA均为阳性，8例患者第4周阳性、第7周阴性，6例患者第4周阴性、第7周阳性。总体而言，45例患者（15.5%）在术后第4周或第7周至少有一次ctDNA检测结果为阳性。接受辅助化疗的ctDNA阳性患者，其5年OS显著低于仅接受观察的ctDNA阴性患者（85.6% vs 95.3%，风险比=3.30，95%置信区间1.20~9.05，P=0.014，图3a）。与总体人群结果一致，17例死亡患者中仅有7例（41.2%）直接因结直肠癌复发导致。45例ctDNA阳性患者中，术后两个时间点均为阳性的患者复发率为20.0%，仅一个时间点为阳性的患者复发率为13.3%（P=0.699）。
图3
本研究还根据T分期，对术后ctDNA阴性的亚组进行了事后探索性分析。结果显示，T3期患者的5年OS和RFS在数值上均高于T4期患者（总生存期：96.0% vs 90.6%，风险比=2.45，95%置信区间0.58~9.25，P=0.171，图3d；RFS：91.7% vs 81.3%，风险比=2.45，95%置信区间0.97~6.22，P=0.051，图3e）。值得注意的是，16例术后ctDNA阴性但出现肿瘤复发的患者中，9例（56.3%）仅发生局部区域复发（腹膜、吻合口、盆腔或肠系膜淋巴结），其中5例T4期复发患者中有4例为局部区域复发。与之相反，术后ctDNA阳性且出现复发的患者，所有8例均发生远处转移（4例仅肝转移，1例仅肺转移，3例为其他转移组合），两组复发部位分布存在显著差异（P=0.015）。
肿瘤突变谱与ctDNA检测：
本研究对所有患者的结肠癌原发灶进行测序，检测了结直肠癌中常见的突变基因，包括TP53、APC、KRAS、BRAF、PIK3CA、SMAD4、FBXW7、AKT1、CTNNB1、ERBB3、GNAS、NRAS、POLE、PPP2R1A和RNF43。突变频率前五的基因对应的ctDNA检出率分别为：TP53（18.1%）、APC（13.0%）、KRAS（20.5%）、PIK3CA（15.6%）和BRAFV600E（6.4%）。携带TP53突变或KRAS突变的肿瘤，其ctDNA检出率在数值上高于野生型肿瘤（TP53：18.1% vs 9.3%，P=0.075；KRAS：20.5% vs 12.1%，P=0.068）；与之相反，携带BRAF V600E突变的肿瘤，其ctDNA检出率在数值上低于BRAF野生型肿瘤（6.4% vs 17.0%，P=0.077）。
分子肿瘤负荷与临床结局：
本研究的一项预设探索性研究终点为分析术后ctDNA水平（分子肿瘤负荷）与ctDNA清除及RFS的关联。在术后ctDNA阳性患者中，以血浆中每毫升肿瘤源性突变分子数（TDMM）衡量分子肿瘤负荷，其中位数为0.38，四分位距为0.135~3.8。肿瘤源性突变分子数高于中位数的患者，其ctDNA清除率更低（75% vs 100%，P=0.047），且RFS更差，两组5年RFS分别为58.9%和95.2%（风险比=10.62，95%置信区间1.34~83.95，P=0.005，图4a）。肿瘤源性突变分子数高于中位数的患者，其5年OS也显著劣于低于中位数的患者（71.8% vs 100%，因其中一组无事件发生，风险比无法评估，P<0.001，图4b）。此外，实现ctDNA清除的患者，其术后ctDNA分子肿瘤负荷低于未实现清除的患者（中位数：0.32 vs 5.35肿瘤源性突变分子/毫升，P=0.016，图4c）。
图4
辅助化疗后的ctDNA清除情况：
ctDNA指导组的45例患者中，40例在辅助化疗结束后4周完成了血浆样本采集（化疗结束时样本）。采用与术后ctDNA检测相同的结直肠靶向检测panel分析发现，35例患者（87.5%）实现了ctDNA清除（术后ctDNA阳性转为化疗结束时ctDNA阴性）。接受奥沙利铂双药化疗的患者中，24/26例（92.3%）实现ctDNA清除；接受氟尿嘧啶单药化疗的患者中，11/14例（78.6%）实现ctDNA清除（图5a）。值得注意的是，1例接受氟尿嘧啶单药化疗且未实现ctDNA清除的患者，因药物毒性仅完成了5周的卡培他滨治疗，其余39例患者均接受了至少3个月的治疗。在重点亚组分析中，T3期（28/32，87.5%）和T4期（7/8，87.5%）肿瘤患者的ctDNA清除率无显著差异；dMMR患者的清除率为75%（3/4），错配修复功能正常型患者的清除率为89%（32/36）。
图5
为评估化疗结束时ctDNA状态对患者远期复发的预测价值，本研究对38例有足量化疗结束时血浆样本的患者进行事后分析，采用两种检测方法（均使用能有效保存模板分子、最大限度降低测序误差的文库制备方法，详见方法部分）进行对比。第一种方法为靶向扩增子测序，检测原发灶中鉴定出的驱动基因突变（如既往研究所述），每位患者平均检测3个驱动基因突变；第二种方法为对所有患者的原发灶进行全外显子测序（WES），鉴定出克隆性存在的乘客基因突变，其中3例患者因全外显子测序仅检测到少量有效变异，额外进行了全基因组测序（WGS）。该基于肿瘤全外显子/全基因组测序的检测方法，为每位患者平均评估29个变异位点（P<0.001，图5b）。
结果显示，基于全外显子/全基因组测序的检测方法因评估的变异位点更多，检测效能更优（图5c），因此本研究选用该方法进行后续分析。7例复发患者中，6例化疗结束时ctDNA检测为阳性（灵敏度86%）；31例无复发患者中，所有患者化疗结束时ctDNA检测均为阴性（特异度100%）。该方法的阳性预测值为100%，阴性预测值为97%（图5c）。化疗结束时ctDNA阴性的患者，5年无复发生存概率为96.8%；而ctDNA阳性的患者，该概率为0%（因其中一组事件发生率为100%，风险比无法评估，P<0.001，图5d）。化疗结束时ctDNA阳性的患者，从随机分组到疾病复发的中位时间为12.2个月（范围6.6~36.2个月）；唯一1例化疗结束后ctDNA阴性但复发的患者，该中位时间为47.5个月。
讨 论
对于Ⅱ期结肠癌患者而言，基于传统临床标准选择辅助化疗方案的获益具有不确定性，因此亟需更个体化的辅助化疗决策方案。DYNAMIC研究的更新数据（含成熟的生存数据）证实，与标准治疗相比，ctDNA指导的辅助化疗方案在不降低患者RFS和OS的前提下，减少了化疗的使用比例。该研究结果在不同患者亚组中均具有稳健性，包括依据T4期、dMMR等传统高低危标准划分的不同复发风险亚组。此外，与既往制定辅助治疗方案的经典试验相比，本研究中当代Ⅱ期结肠癌队列的复发率更低，提示ctDNA指导的治疗方案或能使患者的生存结局随时间持续改善。本研究的进一步分析还发现，多次检测ctDNA可作为评估微小残留病灶的动态标志物，为辅助治疗的疗效和治疗结束时的残留风险提供参考；探索性分析则提示，可通过检测分子肿瘤负荷（TDMM）对术后ctDNA阳性患者进行进一步风险分层，且采用灵敏度更高的检测方法或能提升检测效能。
经过近5年的中位随访，DYNAMIC研究的成熟数据证实，ctDNA指导治疗和标准治疗的Ⅱ期结肠癌患者OS相近。值得注意的是，所有患者均取得了良好的生存结局，5年RFS达88.0%，5年OS达93.6%，且仅有少数患者接受了辅助化疗。该结果并非因研究入组的患者均为低危人群所致——本研究中40%的患者存在高危特征，与预期比例一致。事实上，该结果与早期结肠癌患者生存结局随时间改善的趋势相符，这一改善部分归因于目前基线检查中常规使用的高质量影像学检查，能够检测到既往未发现的低负荷转移性病灶，使部分Ⅱ期患者重新分期为Ⅳ期；另一原因是病理科医生检测的淋巴结数量增加，淋巴结分期更准确，减少了Ⅲ期疾病的漏诊，本研究中仅4.5%的队列淋巴结检出数不足12枚，这一比例符合相关标准。此外，疾病复发后的优化管理也是影响总生存期的重要因素，包括更有效的全身治疗和更多的根治性挽救手术——本研究中超过50%的复发患者接受了根治性挽救手术，这与社区研究中挽救治疗的使用比例增加的报道一致。
尽管ctDNA可检测到是强有力的预后标志物，但传统临床病理危险因素在经ctDNA分层的亚组中仍具有预后价值，其中T4期作为最主要的不良预后因素，也是临床中辅助化疗使用的重要驱动因素。在DYNAMIC研究中，术后ctDNA阴性的T4期患者5年复发率为15%，与所有临床低危Ⅱ期患者的复发率相近，且目前尚无证据表明，未选择的T4期患者能从辅助治疗中获得生存获益。与之相反，错配修复缺陷型肿瘤患者因复发率低，且可能对氟尿嘧啶治疗耐药，诊疗指南不建议其接受辅助治疗，但仍有部分此类患者出现疾病复发。在既往的早期结肠癌观察性研究中，少量未接受治疗的ctDNA阳性dMMR肿瘤患者复发率达66%。DYNAMIC研究则提示，dMMR患者或能从辅助化疗中获益：根据研究方案接受化疗的4例dMMR患者中，3例（75%）实现了ctDNA清除（其中3例接受奥沙利铂为基础的化疗），且在成熟的随访数据中均未出现复发，这一发现仍需进一步验证。
本研究发现，患者在辅助化疗结束时的ctDNA清除率较高，且接受奥沙利铂双药化疗的患者清除率在数值上高于氟尿嘧啶单药化疗患者（92.3% vs 78.6%）。ctDNA阳性患者接受氟尿嘧啶单药化疗后仍能达到较高的清除率，这与非ctDNA选择的临床高危Ⅲ期结肠癌亚组研究结果一致——在该类研究中，奥沙利铂联合氟尿嘧啶的双药方案带来的无病生存获益中，约60%~65%可归因于氟尿嘧啶单药。据研究者所知，氟尿嘧啶单药与奥沙利铂双药方案的ctDNA清除率对比此前尚未见报道。值得注意的是，为减少既往观察性研究中发现的化疗期间ctDNA短暂清除问题，本研究仅在辅助化疗结束后4周这一个时间点评估ctDNA清除情况。即便如此，基于全外显子/全基因组测序的检测方法仍达到了理想的灵敏度（86%）和极高的特异度（100%）。本研究未收集患者监测期间的系列ctDNA样本，而这一检测或能为确定评估ctDNA清除的最佳时间和指标（如单一标志性时间点或多个时间点）提供更多信息。
DYNAMIC研究数据与既往观察性研究数据均表明，辅助化疗后ctDNA持续可检测到的患者属于极高危人群（图5d），在其出现临床可检测的疾病前进行进一步治疗或能使患者获益，目前多项研究正探索该治疗策略。PEGASUS研究的早期数据（随访时间短、样本量小）提示，采用FOLFIRI化疗方案对ctDNA持续阳性患者进行挽救治疗或具有获益。其他研究则在探索既往未在微小残留病灶领域开展试验的药物，包括治疗转移性疾病的有效药物（如曲氟尿苷替匹嘧啶）、针对分子分型亚组的各类靶向治疗，以及低毒性治疗策略（如个性化疫苗）。化疗结束时的ctDNA状态或也能为监测策略的强度制定提供参考，这一点仍需进一步探索，如IMPROVE-IT2试验正在开展相关研究。
除了通过定性检测判断ctDNA阳性或阴性，ctDNA的定量水平（若可检测到）也具有预后意义，或能反映微小残留病灶的“负荷”。在一项对三个早期结直肠癌观察性队列的联合分析中发现，接受辅助化疗的患者中，术后ctDNA突变等位基因分数更高的患者复发风险也更高。DYNAMIC研究数据与该发现一致：术后ctDNA分子负荷更高的患者，辅助化疗后的ctDNA清除率更低，且5年RFS显著更差（风险比=10.62，P=0.005）。GALAXY观察性研究也证实，术后ctDNA分子负荷更高的患者，化疗后实现ctDNA清除的可能性更低。上述数据的直接临床意义在于，未来开展ctDNA指导的治疗研究时，应将ctDNA分子负荷作为分层因素，包括为ctDNA水平较高的患者添加新型治疗方案。此类研究或可仅纳入ctDNA水平较高的患者，因为DYNAMIC研究的小样本队列显示，标准治疗对ctDNA负荷较低的患者疗效显著，清除率达100%；对于这一亚组患者，未来的治疗策略可聚焦于缩短治疗时长或降低治疗强度。
迄今为止，基于tumor-informed ctDNA MRD检测方法对复发的阳性预测值较高，但第一代MRD检测方法在术后的临床灵敏度始终约为50%，提示仍有提升检测灵敏度的空间。显然，这一“假阴性”率是MRD检测常规用于指导辅助治疗降阶的潜在障碍，尤其是在辅助化疗目前被视为标准治疗的情况下。因此，本研究利用化疗结束时的剩余样本，探索了一种新型检测方法。该探索性分析通过平均检测29个肿瘤源性突变，实现了极高的特异度（31例患者均为100%），且灵敏度有所提升（7例患者为86%）。唯一1例化疗结束时ctDNA检测阴性但复发的患者，其复发时间为4年后，远晚于ctDNA检测阳性的患者。上述结果提示，采用如本研究所述的、能同时检测多个突变且特异度极高的检测方法，或能开发出更优的ctDNA检测技术，这一潜力仍需前瞻性临床试验验证。
目前，样本制备方法、分子回收率、基因组DNA污染和定量方法的差异，阻碍了ctDNA检测方法的标准化，使其难以作为MRD检测手段广泛应用。本研究采用的基于SaferSeqS的检测方法，或能从多个方面克服上述挑战：第一，所有检测步骤均可自动化和流程化，分子回收率稳定且较高（>70%）；第二，突变定量无需外部标准，而是依靠检测流程初始阶段引入的分子条形码，对每个初始DNA分子进行唯一标记，从而实现对每个突变分子的精准定量；第三，包括双链测序和分子条形码在内的误差降低策略，能以指数级降低样本制备和测序过程中的误差，这也体现在基于全外显子/全基因组测序的检测方法实现了100%的特异度；第四，该检测方法可在多种测序平台上使用。研究者认为，该方法为下一代MRD检测技术奠定了基础。此外，目前该全外显子/全基因组测序检测方法的耗材成本低于1000美元，且随着现有测序平台成本的降低和更具成本效益的新型测序技术的发展，其成本有望进一步下降。一旦完成全外显子/全基因组测序并构建个性化检测panel，后续每次检测的成本将更低，不足200美元，远低于影像学检查的成本，且具有操作更便捷的优势，仅需采集血液样本即可。
DYNAMIC研究也存在局限性：与传统的辅助化疗试验相比，本研究的入组患者数相对较少，因此未具备检验总生存期非劣效性的统计学效能；此外，部分分析因样本量较小仅为探索性分析，结果仍需在未来的研究中验证。两组患者在奥沙利铂为基础的化疗方案使用上存在不平衡——ctDNA指导组采用该方案的患者比例高出7%，因辅助治疗方案的选择由临床医生决定。这种不平衡可能是导致两组患者化疗使用比例不同但生存结局相近的原因之一，但需注意的是，在关键的随机试验中，氟尿嘧啶联合奥沙利铂对比氟尿嘧啶单药，对患者生存结局的影响极小。奥沙利铂是否仅对ctDNA阳性的Ⅱ期结肠癌亚组患者有益，而非所有患者，仍需进一步探索。此外，奥沙利铂可能导致远期神经毒性，而本研究未专门收集不良事件和生活质量相关数据，这些数据或能帮助全面了解治疗降阶的临床影响。
DYNAMIC研究是实现Ⅱ期结肠癌辅助治疗选择向生物标志物驱动、更个体化方向发展的重要一步。本研究报告的新数据（含成熟的随访结果）证实，ctDNA指导的治疗方案不会降低患者的生存结局；同时也证实，未来的研究仍有提升空间，包括突破定性的二元检测结果、在化疗结束时重复检测（治疗期间和监测期间的检测也值得探索），以及探索更优化的检测方法。目前针对Ⅱ期结肠癌及其他根治性切除场景（包括Ⅲ期结肠癌和切除转移灶的患者）的相关研究正在开展，其结果值得期待。
参考文献：
Tie配资平台股票, Jeanne et al. “Circulating tumor DNA analysis guiding adjuvant therapy in stage II colon cancer: 5-year outcomes of the randomized DYNAMIC trial.” Nature medicine vol. 31,5 (2025): 1509-1518. doi:10.1038/s41591-025-03579-w
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